3D сады


Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях


Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях называется

культивированием, а выращенные на питательной среде микробы – культурой.

Культуры, состоящие из различных видов микроорганизмов, называют

смешанными; культуры, состоящие из одного вида микробов – чистыми.

При специальных способах посева, когда в питательную среду вносит-

ся одна клетка, в результате ее размножения образуется совокупность особей, которая называется клон. Если клон развивается на поверхности плотной питательной среды, по мере роста числа особей он образует видимое невооруженным глазом скопление микробов, которое называется колонией.

Микроорганизмы одного вида, выделенные из определенного источни-

ка внешней среды (из почвы, организма человека, животного, пищевого продукта и т. д.), называются штаммом. Например, если стафилококк одного вида выделен из пяти источников (пяти разных порций продукта, от пяти разных человек и т. д.), считают, что получено, пять штаммов данного вида стафилококка.

Вторичные метаболиты – вещества, образующиеся на поздних фазах развития мко и не участвующие в конструктивном метаболизме клетки. К ним относятся антибиотики, микотоксины, пигменты. В ряде случаев вторичные метаболиты вообще не образуются.

Колония — микробные клетки одного вида, выросшие, в большинстве случаев, из одной клетки в виде изолированного скопления на плотной питательной среде.

Концентрация биомассы (Х) – масса абсолютно сухого вещества клеток мко (АСБ), приведенная к единице объема питательной среды (культуральной жидкости).

Словарь КУЛЬТИВИРОВАНИЕ — выращивание микроорганизмов, животных и растит, клеток, тканей, ... бактерий происходит неинтенсивно, а скорость их роста увеличивается. ...

dbase.aris.ru/N/WIN_R/MSHP/ DEVET/SPRAV_INFO/SL/word3_2.html

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ — выращивание микроорганизмов, животных и растит, клеток, тканей, органов членистоногих в искусственных условиях.

КУЛЬТУРА БАКТЕРИАЛЬНАЯ—популяция жизнеспособных бактерий, выращенная на плотной или в жидкой питательной среде.

КУЛЬТУРА КЛЕТОК, клеточная культура, культура тканей— живущие вне организма в искусственно созданных условиях фрагменты органов или тканей или популяции изолированных клеток млекопитающих. В зависимости от биологич. особенностей и методов культивирования различают несколько типов К. к. перевиваемая, первично трипсинизированная, диплоидная и др.

КУЛЬТУРА МИКРООРГАНИЗМА, культура микробная — совокупность микроорганизмов одного вида, выросших на питательной среде. См. Штамм.

КУЛЬТУРА ЧИСТАЯ, монокультура — культура микроорганизма, содержащая особей лишь одного биологич. вида.

Культивирование микроорганизмов — создание искусственных условий для поддержания процессов жизнедеятельности и размножения микробов in vitro. С этой целью используют питательные (культуральные) среды. Для получения микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в промышленных масштабах используют методы глубинного и непрерывного культивирования.

Культивирование микроорганизмов глубинное - выращивание микроорганизмов в условиях постоянной аэрации жидкой питательной среды. Это достигается с помощью специальных устройств (барботеров), через которые пропускают стерильный воздух. Для повышения эффективности аэрации среда одновременно перемешивается мешалкой. Для глубинного культивирования микробов используются ферментеры разного объема. При непрерывной аэрации и перемешивании среды каждая клетка микробной культуры находится практически в одинаковых условиях. Это намного повышает накопление продуктов микробного метаболизма (антибиотиков), токсинов и др. и микробной массы, а также значительно сокращает время культивирования.

Культивирование микроорганизмов непрерывное - выращивание микробов в условиях постоянного обновления питательной среды в специальных аппаратах — хемостатах, которые снабжены устройствами для автоматической подачи свежей питательной среды и удаления культуральной жидкости с продуктами метаболизма, а также для поддержания температуры и рН на постоянном уровне. Микробная популяция тем самым поддерживается необходимое время в логарифмической фазе роста, что значительно повышает выход микробной массы и продуктов метаболизма.

Культура бактерий «чистая» - скопление микробных клеток одного вида, выращенных на плотной или жидкой питательных средах. Чистые культуры получают из изолированных колоний путем их пересева в отдельные пробирки с питательной средой или из одной исходной микробной клетки, изолированной с помощью микроманипулятора. Выделение чистых культур бактерий необходимо для их идентификации, приготовления вакцин и других целей.

Лимитирующий субстрат – вещество, концентрация которого непосредственно влияет на скорость роста культуры

Метаболиты — соединения, участвующие в метаболических процессах.

Мутагены (мутагенные факторы) — (от лат. mutatio—изменение и греч. genesis — развитие) -вещества, повышающие частоту мутаций. Мутагенами являются ряд химических и физических агентов, которые могут оказывать непосредственное действие на ДНК, на ее предшественников или на РНК (в случае РНК-вирусов).

Механизм действия мутагенов различен. Часть из них действует лишь при синтезе ДНК, другие способны вызывать мутации, действуя на покоящуюся ДНК. Так, азотистая кислота дезаминирует в ДНК азотистые основания, в результате чего после нескольких актов редупликации ДНК в ней происходит замена пар оснований гуанин-цитозин (ГЦ) на аденинтимин (AT). Гидроксиламин во внеклеточных вирусах действует только на цитозин, что приводит к замене ГЦ на AT. Этилэтансульфонат и этилметансульфонат вызывают алкилирование гуанина и его отщепление от рибозофосфатного скелета и другие повреждения в ДНК. Формальдегид реагирует с азотистыми основаниями по аминогруппам, образуя мостики между основаниями — сшивки. Аналог тимина, 5-бромурацил (БУ), замещает тимин у фагов и бактерий в процессе редупликации их ДНК, что в конечном счете может привести к замене пары AT на ГЦ или наоборот. Так называемые супермутагены (нитрозонитрометилгуанидин и нитрозопроизводные мочевины) алкилируют цитозин, вызывая его замену тимином. Они характеризуются чрезвычайно высокой эффективностью при незначительном летальном действии, извращают синтез предшественников ДНК, дезаминируют некоторые основания. К физическим мутагенам относятся рентгеновские и ультрафиолетовые лучи. Они оказывают прямое повреждающее действие на основания ДНК. Кроме того, ряд окислительных и деструктивных процессов возникает под действием свободных радикалов, образующихся в среде, УФ-облучение приводит к образованию тиминовых димеров — «сшивок» между соседними молекулами тимина. Общее число достаточно изученных мутагенов в настоящее время измеряется несколькими сотнями.

Первичные метаболиты – низкомолекулярные соединения, являющиеся промежуточными продуктами конструктивного метаболизма клетки, т.е. служащие для биосинтеза различных ее структур (аминокислоты, нуклеотиды, органические кислоты, витамины, промежуточные продукты гликолиза и ЦТК).

Продукты метаболизма микроорганизмов — включают микробные ферменты, продукты разложения субстратов окружающей среды, микробные токсины, антибиотические вещества (см. Антибиотики), пигменты, бактерий и др. Многие продукты метаболизма (продукты брожения, антибиотики и др.) нашли широкое практическое применение. Обнаружение таких продуктов метаболизма, как ферментов, индола, аммиака, сероводорода и др., используется для идентификации микроорганизмов.

Простейшие (Protozoa) — одноклеточные животные организмы, имеющие дифференцированное ядро, вакуоли (пищеварительные, сократительные) и различные включения. Патогенные простейшие относятся к четырем классам: жгутиковые, саркодовые, споровики, ресничатые.

Протеазы (протеолитические ферменты) — большая группа ферментов, избирательно или неспецифически катализирующих гидролитическое расщепление пептидных связей в белках и пептидах.

Размножение микроорганизмов — бинарное деление одноклеточных микроорганизмов (бактерий, риккетсий, простейших, дрожжей), в результате которого образуются две новые дочерние полноценные особи, наделенные генетической информацией материнской клетки. Дрожжеподобные грибы могут размножаться почкованием, спорами; плесневые грибы и актиномицеты размножаются обычно спорами.

Рост – необратимое увеличение живой клеточной массы, приводящее к увеличению числа клеток мко в результате размножения. Важнейшей количественной характеристикой этого процесса является удельная скорость роста (µ), выражающая увеличение биомассы клеток в единицу времени.

Таким образом, ростовые процессы приводят к накоплению биомассы, которая в ряде случаев является целевым продуктом.

Споры у бактерий — круглые или овальные образования, формирующиеся внутри бактериальной клетки обычно при неблагоприятных условиях внешней среды, аэробные или анаэробные бактерии, образующие споры, называют бациллами. Спора окружена двух- или трехслойной оболочкой, которая формируется за счет цитоплазмы вегетативной клетки. Внутренняя часть двухслойной оболочки образована самой плазмой споры, в которой содержится нуклеоид. Спора содержит значительно меньше воды, чем вегетативная клетка. Вследствие толщины оболочки и плотности содержимого споры очень устойчивы к нагреванию, высушиванию, дезинфицирующим средствам и другим агентам. Они непроницаемы для большинства красителей. Окрашивают споры по способу Ожешко или Циля — Нильсена.

Сверхсинтез, то есть способность микроорганизма синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности

Селекция – это направленный отбор мутантов, то есть микроорганизмов, наследственные признаки которых претерпели изменения в нужном для человека направлении.

Среда питательная — среда, использующаяся в микробиологической практике для выращивания различных микроорганизмов. Ее готовят из естественных продуктов животного и растительного происхождения (мяса, молока, яиц, отрубей, картофеля, моркови), а также из искусственно полученных из этих продуктов веществ (пептона, аминопептида и др.). По целевому назначению питательные среды можно разделить на основные (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон), дифференциально-диагностические (среды Гисса, Эндо и др.) и элективные (среда Леффлера и др.). Большое практическое значение приобрели синтетические питательные среды. Они состоят из растворов химически чистых неорганических и органических соединений в концентрациях, точно установленных на основании изучения потребностей микро­организмов в питательных веществах. Эти среды находят специальное применение в исследовательской работе и микробиологической промышленности. В генетических исследованиях используют среды минимальные и селективные.

Среда полная — питательная среда, содержащая все необходимые ингредиенты для. роста ауксотрофных бактерий.

Стерилизация (от лат. sterilis— бесплодный) — полное уничтожение как вегетативных форм микроорганизмов, так и их спор. Стерилизация осуществляется 1) физическими методами — нагреванием воздуха в сушильном шкафу до 160—180° («сухим жа­ром»); паром под давлением от 0,5 атм до 1,5 атм (температурой ПО—120°) в автоклаве; ультрафиолетовым облучением; 2) механическим способом путем фильтрации жидкостей через асбестовые, нитроцеллюлезные и другие фильтры, приготовленные из пористых материалов; 3) химическим методом путем обработки материала дезинфицирующими или анти­септическими веществами. Выбор того или другого.

Токсигенность — способность бактерий продуцировать экзотоксины или образовывать эндотоксины. Токсигенность детерминируется определенными генами.

Токсины бактерий — биологически активные вещества которые могут вызывать разнообразные патологические изменения в структуре и функциях клеток, тканей, органов и целого макроорганизма чувствительного животного или человека. Сведения о механизмах действия бактериальных токсинов огра­ничены: известно, что у части токсинов активность обусловлена их ферментативными свойствами. Грамположительные бактерии обычно активно секретируют в токсины во время роста, что приводит к их накоплению в среде обитания. Токсины грамотрицательных бактерий (например, кишечного семейства) связаны с липополисахаридным компонентом клеточной стенки.

Фаг — син. бактериофаг, бактериальный вирус (от греч. phagos — пожирающий, хотя термин «Фаг» по Д'Эррелю обозначает не «пожирать», а «развиваться за счет кого-либо») — вирусы, хозяевами которых являются бактерии.

Фаги подразделяют на вирулентные и умеренные. Вирулентные вызывают продуктивную инфекцию, которая завершается лизисом зараженных бактерий. Умеренные фаги могут лизогенизировать бактериальные клетки. Фаги обычно называют по наименованию основных бактериальных хозяев. Они состоят из головки и отростка, которые имеют различные размеры. Хорошо изученными являются колидизентерийные Т-фаги. Четные Т-фаги обладают головкой гек­сагональной формы, отростком с сокращающимся чехлом, который заканчивается базальной пластинкой. К последней прикрепляются нити отростка. Многие фаги не имеют сокращающегося чехла отростка. У некоторых фагов не обнаружено отростка. Фаги широко применяются в качестве модельных систем в молекулярной генетике, а также в практической медицине. Термин введен Д'Эррелем в 1917 г.

Ферментация (культивирование) - это вся совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала (инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды.

Ферменты (энзимы) микроорганизмов — биологические катализаторы, участвующие во всех метаболических процессах, протекающих в микробных клетках.

Имеют белковую природу. По современной классификации ферменты делят на 6 классов. Каждый класс подразделяется на подклассы и подподклассы в зависимости от природы индивидуальных превращений. У микробов встречаются ферменты всех 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Микробные ферменты подразделяются на конститутивные и индуцируемые. Синтез последних регулируется механизмом репрессии— дерепрессии Разные виды микроорганизмов отличаются друг от друга по набору ферментов, которые они способны синтезировать. Это имеет дифференциально-диагности­ческое значение при их идентификации. Некоторые патогенные бактерии продуцируют особые ферменты—гиалуронидазу,лецитиназу, плазмокоагулазу, фибринолизин, ДНК-азу,РНК-азу и др., которые способствуют проявлению их патогенных свойств и рассматриваются как факторы патогенности.

Фитонциды — антимикробные вещества растительного происхождения. См. Антибиотики

изменение, превращение) – промежуточные превращения веществ в микробных клетках. Наиболее выражены в логарифмической фазе роста микробной культуры.

Хемостат (хемо- + греч. states стоящий, установленный) - аппарат для непрерывного культивирования бактерий, обеспечивающий оптимальные температурные условия и постоянное поступление свежей питательной среды при одновременном удалении части бактериальной культуры

Штаммы (от нем. stammen — происходить) — культуры бактерий одного вида, выделенные из различных источников или из одного источника в разное время.

Разные штаммы одного и того же вида бактерий могут отличаться друг от друга по целому ряду свойств, например по чувствительности к антибиотикам, способности к образованию токсинов, ферментов и пр.

Экономический коэффициент – отношение прироста биомассы к потреблению субстрата

Эффективность биотехнологического процесса (Y) в данном случае оценивается выходом продукта по субстрату («экономический коэффициент»): Y = ΔХ/ΔS.

В ряде случаев целевыми продуктами выступают продукты жизнедеятельности мко, которые разделяют на первичные и вторичные метаболиты.

АВТОТРОФЫ - autotrophs. Организмы, синтезирующие из неорганич. соединений органич. вещества с использованием энергии Солнца или энергии, освобождающейся при химич. реакциях (см. Хемотрофы). К А. относятся высшие растения (кроме паразитных и сапрофитных), водоросли, нек-рые бактерии (пурпурные, железобактерии, серобактерии и др.). А. Противопоставляются гетеротрофам. В пищевой цепи А. служат продуцентами. В подземных водах к ним относятся бактерии, использующие для жизнедеят-ти минеральные соединения. Обычно источником углерода служит углекислый газ, а источником энергии - химические реакции и световое излучение. Наиболее распространены серобактерии, железобактерии, нитрифицирующие и др.виды бактерий. Очень велика роль А. в круговороте веществ в природе.

Адаптация

- [позднее лат. adaptatio - приспособление, прилаживание] совокупность морфофизиологических, популяционных и других свойств живых организмов, обеспечивающих возможность устойчивого выживания в конкретных условиях среды. Различают общую А. (приспособление к широкому диапазону условий среды) и частные А. (приспособление к локальным или специфическим условиям среды). Многочисленные факторы экологические подразделяют на адекватные и неадекватные врожденным и приобретенным свойствам организма. К адекватным условиям среды организмы адаптированы в результате длительной эволюции и онтогенеза, в результате чего у них сформировались устойчивые адаптивные механизмы. В неадекватных условиях полной А. организмы достигают не всегда. К некоторым факторам среды А. может быть частичной, в крайне же экстремальных условиях организмы могут оказаться полностью не способны к А.. В последнем случае организмы ищут более подходящую среду, и возникают процессы миграции и реиммиграции.

АДАПТАЦИЯ

Совокупность морфофизиологических, поведенческих, популяционных и других особенностей вида, обеспечивающая возможность специфического образа жизни в определенных условиях внешней среды.

Совокупность способов адаптации придает строению и жизнедеятельности организмов черты целесообразности.

Адаптация называется также сам процесс выработки приспособлений организмов к условиям их существования.

Существует:

Биологическая адаптация

Bидоспецифическа наследственна приспособляемость организмов к воздействиям окружающей среды (климат, питание, враги, половые партнеры и др.), развивающаяся в ходе эволюции и проявляющаяся в том, что все особи одного вида приспособлены к определенным особенностям окружающей среды.

Примером может служить развитие у насекомоядных птиц более острого клюва, приспособленного для добывания пищи в древесной коре.

Физиологическая адаптация

Приспособляемость органов чувств к длительному воздействию раздражителей. При этом возбуждение, первоначально сильное, постепенно снижается до некоторого постоянного уровня. Пример - привыкание к шуму.

Глаз также может приспосабливаться к различным раздражающим ситуациям, например адаптироваться к свету или темноте.

Адаптация к раздражениям через прикосновение может быть столь полной, что импульсы возбуждения не возникают вообще.

Аккумуляция

- (лат. Аккумуляцио - накопление, собирание). 1) накопление в организмах химических веществ (например, пестицидов в жировой ткани животных, металлов в растениях), находящихся в окружающей их среде в меньшей концентрации; 2) в пищевой цепи - многократное (иногда в сотни раз) увеличение концентрации веществ на каждой следующей ступени экологической пирамиды, связанное с тем, что количество поедаемой пищи значительно превышает массу потребителя, а химические агенты не полностью выводятся из организма с выделениями. Такая аккумуляция приводит к опасным последствиям - массовым отравлениям организмов на высших ступенях экологической пирамиды, в том числе людей; 3) накопление организмом физических агентов (например, радиоактивных). Синонимы: кумуляция, биоакумуляция. Синоним биоаккумуляция, кумуляция.

Аккумуляция загрязнителей организмами

- процесс накопления в живых организмах химических веществ, загрязняющих среду обитания, в результате усвоения их в процессе питания. Поскольку объем подаваемой пищи за длительное время значительно превышает массу потребителя, а загрязнители не во всех случаях полностью выводятся из организма с выделениями, на каждом следующем уровне экологической пирамиды (биомассы) создается многократно более высокая концентрация загрязнителя.

Биоаккумуляция

- характеристика присутствия химического вещества в живом организме, когда количество поглощенного этим организмом вещества больше количества выведенного вещества. Это приводит к увеличению концентрации вещества в тканях.



infopedia.su

Культивирование микробов в лабораторных условиях

Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально). Питательные среды могут быть жидкие и плотные. В зависимости от свойств микробов используют разные среды. Их делят на 4 группы:

1) простые (универсальные) - на них растут только неприхотливые (не требовательные к питательному субстрату) микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА и МПБ - мясопептонный агар и бульон.

2) сложные (специальные) - на них растут прихотливые микробы (стрептококки, пневмококки). Они готовятся из простых сред путем их обогащения:

- сахарный агар,

- кровяной агар.

3) элективные (избирательные) - на них растет только один род микробов, а другие – нет. Например: 1%щелочная пептонная вода - для холерного вибриона, сахарный агар - для стрептококка, сывороточный агар - для дифтерийной палочки и т.д.

4) дифференциально-диагностические - для отличия одного вида от другого по ферментативной активности (среда Эндо, Гисса).

Требования к питательным средам:

- питательность

- изотоничность

- оптимальная реакция среды (рН 7.2 – 7.4)

- влажность

- стерильность

- буферность

- унифицированность

Питательные среды (состав некоторых питательных сред)

Кровяной агар. Используют для выявления экзотоксина – гемолизина у бактерий. К расплавленному и охлажденному до 45°С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.

Пептонная вода. Используют для культивирования холерных вибрионов. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8-8,9, стерилизуют.

Свернутая сыворотка. Применяют для культивирования прихотливых бактерий (например, дифтерийной палочки). Для приготовления свернутой сыворотки используют нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота. Можно пользоваться человеческой сывороткой (отходами производства гамма-глобулина). Для свертывания сыворотку стерильно разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки укладывают в ряд (скос должен начинаться от дна пробирки) в аппарате для свертывания, подогретом до 500C. Температуру доводят постепенно до 800C и держат в нем пробирки 1 ч. Затем пробирки со свернутой сывороткой вынимают (так как дальнейшее нахождение их в свертывателе ведет к высыханию сыворотки) и охлаждают при комнатной температуре. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду.

Среды Гисса с углеводами. Дифференциально-диагностическая среда, на которой выявляют разложение углеводов микроорганизмами. Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде - 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

Мясопептонный агар (МПА). Применяют для выращивания большинства сапрофитных бактерий. К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С.

Среда 199. Используют для выращивания культур клеток. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Для выращивания клеток (как ростовую) среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.

Среда Эндо. Дифференциально-диагностическая среда для культивирования бактерий кишечной группы. Готовят непосредственно перед применением. К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

Среда Левенштейна-Йенсена. Используют для культивирования микобактерий туберкулеза. Для приготовления этой среды в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют: аспарагина 3,6 г, фосфата калия однозамещенного 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют 15 мин при 120 °С. Готовят 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45-60°С, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и оставляют для свертывания в наклонном положении при 85°С 45 мин.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов. Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые препятствуют размножению других микробов, что обеспечивает элективность среды. Готовят среду из питательного солевого агара. В расплавленный и остуженный до 45 0С агар добавляется куриный желток.

Среда Сабуро. Предназначена для выращивания дрожжевых и плесневых грибов. Содержит пептон -10,0 г/л; глюкозу - 40,0 г/л; агар-агар — 15,0 г/л. Благодаря содержанию 4% глюкозы наблюдается оптимальный рост грибов, а рН 5,6 подавляет рост бактерий.

Тиогликолевая среда. Используют для культивирования и выделения облигатных и факультативных анаэробов и микроаэрофильных бактерий и теста на стерильность различных биоматериалов. Казеиновый пептон 15,0; дрожжевой экстракт 5,0; глюкоза 5,5; L-цистин 0,5; хлористый натрий 2,5; тиогликолят натрия 0,5; резазурин натрия 0,001; агар-агар 0,75. Редуцирующие вещества, такие как тиогликолят и цистин - обеспечивают анаэробные условия, достаточные даже для строгих анаэробов. Более высокая вязкость жидкой тиогликолевой среды защищает растущую культуру от быстрого проникновения кислорода. Любое увеличение содержания кислорода регистрируется окислительно-восстановительным индикатором резазурином натрия, который при этом краснеет. Инокулируют питательную среду исследуемым материалом, следя за тем, чтобы он попал на дно пробирки. Для создания анаэробных условий, на поверхность питательной среды можно наслоить стерильное парафиновое масло или агар-агар высотой 1 см. Инкубировать в течение нескольких дней при оптимальной температуре 37оС. Анаэробы растут в нижней части пробирки.

К работе № 3, 4

Техника посева на жидкие и плотные питательные среды

Методы, основанные на механическом разобщении микробов

Метод Дригальского

Берут 3 чашки Петри с МПА, стерильной пипеткой материал помещают на поверхность МПА в чашку № 1

посев шпателем (газоном) посев петлей (штрихом)

Стерильным шпателем материал Чашку Петри с МПА делят на

тщательно распределяют по 4 сектора. Исследуемый мате-

поверхности агара. Затем, не беря риал стерильной петлей вносят

нового материала и, не обжигая в 1 сектор и делают штрихи,

шпателя, делают посев на 2 и 3 затем такие же линии проводят

чашку МПА. и на других секторах.

На последних секторах вырастают

отдельные колонии.

1 2 3 1 2

изолированные колонии 4 3

4 сектор - изолированные колонии

Снижение концентрации микробов

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Метод седиментации по Коху -основан на свободном оседании микроорганизмов на питательную среду в чашку Петри из воздуха. Применяется для определения загрязненности воздуха микроорганизмами.

Метод укола -применяется для выращивания анаэробов или выявления характерного признака микроба, т.к. рост по ходу укола типичен для ряда бактерий. Также применяется для длительного хранения культур.

Посев на скошенный агар – применяется для накопления биомассы, получения чистой культуры и их хранения.

Метод фильтрации основан на пропускании исследуемого материала через специальные фильтры с определенным диаметром пор и разделение содержащихся микроорганизмов по величине.

Этот метод применяется для очистки вирусов от бактерий, а также при получении фагов и токсинов (в фильтрате - чистый фаг, очищенный токсин).

Методы, основанные на биологических свойствах микроорганизмов

Метод Шукевича

Техника посева. Исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара. При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды дают «ползущий» рост по скошенному агару. Для получения чистой культуры ее отсевают с верхнего края посева.

Метод прогревания

Позволяет отделить спорообразующие бациллы от неспоровых форм. Прогревают исследуемый материал на водяной бане при 80°С 10-15 мин. Вегетативные формы погибают, а споры сохраняются и при посеве на соответствующую питательную среду прорастают.

Бактериостатический метод (метод ингибирования)

Основан на избирательном действии некоторых химических веществ и антибиотиков на микроорганизмы. Например, антибиотики позволяют очистить исследуемый вируссодержащий материал от сопутствующей бактериальной флоры. Серная кислота (5% р-р) быстро убивает большинство бактерий, а туберкулезная палочка выживает в этих условиях.

Метод заражения лабораторных животных или растений

Применяют в целях выделения и идентификации патогенных микроорганизмов и отделения их от сапрофитной флоры. Для заражения подбирают наиболее восприимчивые к предполагаемому возбудителю инфекции виды животных или сорта растений.

После появления у зараженных организмов признаков болезни их убивают и производят посев органов и тканей на питательные среды. При выделении и изучении облигатных паразитов этот метод является основным и единственным.

Посев на жидкие питательные среды

Применяют для изучения типа дыхания микробов. Посев проводится петлей или пипеткой. Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион) – рост на поверхности питательной среды; факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка) – диффузный рост в толще питательной среды; анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены) – придонный рост.

к работе № 5

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском гугл на сайте:

zdamsam.ru

Выращивание микроорганизмов

Казахстанско-Российский медицинский университет

Кафедра Микробиологии с основами иммунологии

СРС

На тему: ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Выполнила: Ильясова А.М.

Факультет: стоматологический гр. 206

Алматы 2014.

ПРИНЦИПЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Микроорганизмы (за исключением облигатных внутриклеточ­ных паразитов — риккетсий, хламидий, вирусов и простейших) культивируют, как правило, на искусственных питательных средах. В зависимости от пищевых потребностей того или другого вида питательные среды должны содержать соответствующие исходные вещества, необходимые для пластического и энергетического метаболизма.

Выделение микроорганизмов из различных материалов и по­лучение их культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных за­болеваний, в научно-исследовательской работе и в микробиоло­гическом производстве вакцин, антибиотиков и других биоло­гически активных продуктов микробной жизнедеятельности.

Условия культивирования также зависят от свойств соответ­ствующих микроорганизмов. Большинство патогенных микробов выращивают на питательных средах при температуре 37 °С в те­чение 1—2 сут. Однако некоторые из них нуждаются в более длительных сроках. Например, бактерии коклюша — в 2—3 сут, а микобактерии туберкулеза — в 3—4 нед.

Для стимуляции процессов роста и размножения аэробных микробов, а также сокращения сроков их выращивания ис­пользуют метод глубинного культивирования, который заключа­ется в непрерывном аэрировании и перемешивании питательной среды. Глубинный метод нашел широкое применение в биотех­нологии.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его инертными газами, в герметизированных термостатах — анаэростатах. Анаэробов выращивают на питательных средах, содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокис-лый натрий и др.). уменьшающиеокислительно-восстановитель­ный потенциал.

Выращивание микроорганизмов

Питательные среды должны бытьтакими, что легко усваиваются, с определенным составом азотистых веществ, углеводов, витаминов и соответствующей концентрацией солей, изотоническими, стерильными, иметь буферные свойства, оптимальную вязкость и определен окислительно восстановительный потенциал.

Микроорганизмы, которые нуждаются в высоких концентрациях солей, называют галофильними.Они распространены в морях, океанах, соленых озерах. К ним принадлежат некоторые патогенные для человека виды (Vibrioparahaemolyticus и др.).

В течение всей истории микробиологии питательные среды постепенно совершенствовались. В допастеровский период как среды для выращивания микроорганизмов применяли только настои и отвары. Л. Пастер и К. Негели внедрили в практику культивирования безбелковые среды.

Р. Кох и Ф. Леффлер для выращивания бактерий использовали мясную воду, пептон и натрия хлорид. Эта среда являет собой мясо-пептонный бульйон (МПБ), из которого готовят мясо-пептонныйагар (МПА), добавляя 1—2 % агара.

Агар — твердый волокнистый материал, который добывают из некоторых водорослей. В водных растворах он образует густой гель (студень). Агар состоит из 70—75 % полисахаридов, 2—3 % белков и других азотсодержащих веществ, 2—4 % золы. Основными компонентами агараявляются высокомолекулярные вещества — агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при нагревании и охлаждается при комнатной температуре. Его выпускают в виде бесцветных пластинок или порошка. Благодаря свойству агара предоставлять питательному субстрату при охлаждении консистенцию густого геля и высокой стойкости к ферментативному действию микроорганизмов его широко применяют при изготовлении полужидких, плотных и сухих питательных сред.

Разработана методика изготовления синтетического полимерного материала, который используется для приготовления густых питательных сред и с успехом заменяет естественный дефицитный агар.

Требования к питательным средам. Для выращивания бактерий в лабораторных условиях, исследования их разнообразных свойств, длительного хранения используют питательные среды. Они должны отвечать определенным стандартам, создавая оптимальные условия для роста, размножения и жизнедеятельности микроорганизмов.

В первую очередь, бактерии нуждаются в азоте, углероде и водороде для построения собственных белков. Водород и кислород для клеток поставляет вода. Источником азота выступают многочисленные вещества, в основном, животного происхождения (мясо говяжье, рыба, мясо-костная мука, казеин), а также белковые гидролизаты, пептиды, пептоны. Можно использовать и заменители мяса – плаценту, кровяные сгустки, дрожжи. Следовательно, в состав сред должны быть введены источники питательных веществ и вода, а также ростовые факторы (витамины группы В, ферменты). Универсальным источником их служат экстракты из белков животного и растительного происхождения, белковые гидролизаты. Для микробов с более сложными пищевыми потребностями в состав сред включают нативные субстраты – кровь, сыворотку, асцитическую жидкость, яичный желток, кусочки печенки, почек, мозговой ткани и др.

Среды должны быть сбалансированными за микроэлементным составом и содержать ионы железа, меди, марганца, цинка, кальция, натрия, калию, иметь в своем составе неорганические фосфаты.

Допускается применение веществ, которые устраняют действие ингибиторов роста и токсиноутвореннямикробов (отдельные аминокислоты, твіни, активирован уголь и тому подобное). Важной является стабилизация оптимума рН среды, его высокой буферності и уровень окислительно восстановительного потенциала (Еh), который для аеробних микроорганизмов достигает свыше 0,08 В, а для анеробних бактерий колеблется в пределах 0,12-0,60 В.

Среды должны иметь определенную вязкость, плотность, иметь определенную влажность (до 20 % воды), быть изотоническими, прозрачными и обязательно стерильными.

Oсновныетребования к питательнымсредам:

1. прозрачность,

2. стерильность

3. лёгкая усвояемость

4. определенный состав азотистых веществ, углеводов, витаминов,

5. изотоничность,

6. определённая вязкость и окислительно-восстановительный баланс

Основные питательные среды. Многочисленные потребности микроорганизмов предопределяют большое разнообразие питательных сред, а для отдельных видов бактерий существуют специальные среды. Часть их готовят в лабораториях непосредственно перед посевом, но с каждым годом появляются все новые и новые среды заводского изготовления (сухие), которые способны удовлетворить самые прихотливые потребности микробиологов. Они сохраняются длительное время, имеют стандартный состав.

Среды разделяются на естественные и искусственные. Как естественные используют свернутую сыворотку, молоко, яйца, мышечную ткань. Искусственные среды создают путем комбинирования разнообразных субстратов, которые обеспечивают те или другие потребности микроорганизмов. Их используют в основном для экспериментального изучения отдельных звеньев метаболизма бактерий.

В зависимости от своей плотности, среды разделяются на жидкие, полужидкие и плотные. Полужидкие и плотные среды готовятся из жидких, добавляя соответственно 0,3-0,7 % но 1,5-2,0 % агара. Последний представляет собой волокнистый материал, который добывают из морских водорослей. Состоит он из полисахаридов (70-75 %), белков (2-3 %), основными составляющими частями является высокомолекулярные агароза и агаропептин. Агар растворяется в воде при повышенной температуре, а, застигая, предоставляет среде драглеподібної консистенции и стойкости к ферментным системам бактерий. Именно за эти свойства он приобрел широкое распространение в микробиологической практике. Для создания плотных сред используют также желатин (10-15 %), свернутую сыворотку крови.

mylektsii.ru

Культивирование микроорганизмов

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Министерство Образования и Науки Республики Казахстан

Казахстанский инженерно-технологический университет

Реферат

По дисциплине «Основы биотехнологии»

Тема «Культивирование микроорганизмов»

Подготовила: Шайдулинова Айнур

2 курс спец. ПОВ

Проверил: Фалеев Д.Г.

Алматы-2016

Содержание

1. Требования микроорганизмов к питательным веществам

2. Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

3. Способы культивирования микроорганизмов

3.1 Периодическое культивирование

3.2 Непрерывное (проточное) культивирование

1. Требования микроорганизмов к питательным веществам

Культивирование микроорганизмов - это один из основных приемов в микробиологии. Для роста и развития микроорганизмов в природе и в лабораторных условиях необходимо наличие питательных веществ для энергетических и конструктивных реакций. Требования разных групп микроорганизмов к источникам энергии и химическим элементам определяются их метаболическими возможностями. Выращивание и поддержание микробных культур в лаборатории основано на моделировании естественных условий обитания данного организма в лаборатории, а также на знании особенностей обмена веществ.

Основными биогенными элементами являются углерод, азот, фосфор, кислород, водород, сера. Это компоненты белков, углеводов и жиров, а также нуклеиновых кислот. Эти элементы требуются в значительных количествах (г/л) и поэтому их называют макроэлементами. К макроэлементам также относятся ионы калия, магния, натрия, кальция и железа. Они выполняют в клетке разнообразные функции

Микроэлементы, необходимые в микромолярных количествах, - это ионы таких металлов, как хром, кобальт, медь, молибден, марганец, никель, селен, вольфрам, ванадий, цинк, обычно входящие в состав ферментов и кофакторов. Необходимые для микроорганизмов количества микроэлементов содержатся в обычной водопроводной воде. При работе на дистиллированной воде микроэлементы добавляют специально в виде растворов их минеральных солей.

Источники углерода и азота в среде могут быть как неорганическими соединениями (СО2, N2, карбонаты, нитриты, нитраты, аммонийные соли), так и органическими веществами разной степени сложности и окисленности (сахара, спирты, органические кислоты и аминокислоты, олигосахариды, пептиды и т.д.).

У некоторых микроорганизмов спектр потребляемых органических веществ очень широк (например, у Pseudomonas, Actinomyces), у других - достаточно узок (например, у облигатных метилотрофов Methylobacterium). В то же время, можно найти микроорганизмы, способные использовать сложные неприродные соединения типа пластиков, красителей, пестицидов. У некоторых микроорганизмов потребности в питании так сложны, что они растут только внутри живого организма (например, внутриклеточные паразиты Rickettsia и Chlamydia).

Как правило, лабораторные среды содержат питательные вещества в более высоких концентрациях, чем это присуще природным местообитаниям. Важным условием успешного культивирования является поддержание оптимальных значений таких параметров, как рН, температура, освещенность, аэрация и т.д.

2. Типы сред и способы культивирования микроорганизмов

Разнообразные питательные среды, используемые в микробиологической практике для культивирования микроорганизмов, подразделяются по составу, физическому состоянию и назначению.

По составу среды делятся на натуральные и синтетические. Синтетические среды применяют для изучения обмена веществ у микроорганизмов. Они имеют определенный химический состав с точным указанием концентрации каждого соединения. Натуральные среды применяют для накопления биомассы микроорганизмов и широко используют для первичного выделения из естественных субстратов, поскольку их состав позволяет удовлетворить питательные потребности многих групп микроорганизмов. В них содержатся богатые различными органическими веществами продукты животного или растительного происхождения, имеющие сложный и непостоянный состав. Часто натуральные среды готовят на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) и солодового сусла. МПБ - это прокипяченный экстракт мясного фарша с добавлением пептона и поваренной соли. Он богат азотсодержащими органическими соединениями, но обеднен углеводами. Солодовое сусло, напротив, содержит преимущественно углеводы. Его получают путем настаивания размолотого солода в водопроводной воде при постепенном нагревании. Солодом называют пророщенные и высушенные зерна ячменя. В процессе приготовления сусла происходит гидролиз крахмала ячменя и экстракция сахаров в воду. Сусло с разной концентрацией сахаров применяют для выращивания разных групп микроорганизмов.

Жидкие среды представляют собой растворы или суспензии ингредиентов в воде. В качестве сыпучих сред применяют наборы длительно хранящихся сухих компонентов, которые перед работой растворяют или смачивают водой. Это могут быть зерно, отруби, твердые отходы сельского хозяйства и пищевой промышленности. В настоящее время получили широкое распространение порошкообразные синтетические и натуральные среды. Для получения твердых сред в жидкую основу добавляют уплотняющие агенты. Наиболее известными отвердителями являются желатин, агар и силикагель.

По назначению среды подразделяются на универсальные, элективные и индикаторные. Универсальные среды используют для накопления микробных клеток и первоначального выявления видового разнообразия микроорганизмов в смешанных популяциях. Они позволяют поддерживать рост значительного числа микроорганизмов. Элективные среды используют для получения накопительных культур как первого этапа при выделении чистой культуры из природных местообитаний. Для быстрого выявления определенных групп микроорганизмов или особенностей их метаболизма применяют индикаторные среды, содержащие вещество-индикатор, реагирующий изменением цвета на проявление какого-либо свойства организма.

3. Способы культивирования микроорганизмов

3.1 Периодическое культивирование

Особенности роста микроорганизма иногда служат одним из критериев при определении его систематического положения. Микробные клетки в зависимости от условий могут расти в виде суспензии, микроколоний или обрастаний в жидких средах и образовывать колонии, штрихи или газон на твердых средах. Глубинные колонии формируются в толще агаризованных сред в виде чечевичек, тонких пленок или пучков ваты. Поверхностные колонии отличаются большим разнообразием формы, размера, цвета, профиля. Колония может быть прозрачной, плотной, мягкой, хрупкой, врастать в агар, сниматься целиком в виде пленки, тянуться за петлей и т.д. Ее поверхность может быть блестящей или матовой, гладкой или шероховатой, иметь различные выпуклости, исчерченность и т.д. При посеве штрихом (прямой линией по агару) рост бывает обильный или скудный, сплошной или в виде цепочек очень мелких колоний, перистый, древовидный с различной формой края. При развитии культуры в жидких средах развитие микроорганизма может приводить к окрашиванию среды и появлению запаха, образованию пены и пузырьков, появлению помутнения, пленки на поверхности среды или осадка на дне сосуда.

Различают два основных способа культивирования микроорганизмов - периодическое и непрерывное.

При периодическом культивировании клетки помещают в закрытый сосуд определенного объема, содержащий питательную среду, и задают начальные условия.

Постепенно увеличивается плотность популяции, снижается концентрация питательных веществ и накапливаются продукты обмена, т.е. условия существования микроорганизмов изменяются. Периодическую культуру обычно рассматривают как замкнутую систему, переживающую разные фазы развития. микроорганизм культивирование питательный

Лаг-фаза - это фаза «привыкания» клеток к среде, при этом происходит увеличение количества ДНК и РНК и индукция синтеза соответствующих ферментов. Лаг-фаза удлиняется, если брать старый посевной материал и переносить клетки в совершенно новую по составу среду.

В экспоненциальной фазе клетки растут и делятся с максимальной скоростью, их рост не ограничен. Обычно такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях. По мере исчерпания субстратов и накопления продуктов обмена скорость роста снижается (фаза замедления роста) и культура переходит в стационарную фазу, в течение которой процессы деления и отмирания клеток в популяции находятся в динамическом равновесии. Когда исчерпание питательных веществ и накопление продуктов метаболизма преодолеют некие пороговые концентрации, начинается фаза отмирания и число клеток в популяции постепенно снижается.

3.2 Непрерывное (проточное) культивирование

Непрерывное (проточное) культивирование позволяет зафиксировать культуру в какой-то определенной фазе (обычно экспоненциальной). При этом состав среды и условия роста остаются постоянными. Этого добиваются постоянным прибавлением новой питательной среды в сосуд для выращивания и одновременным удалением такого же количества среды с клетками.

Некоторые микроорганизмы способны к пребыванию в особом физиологическом состоянии, при котором живые клетки не дают колоний на пригодных для них лабораторных средах, но под микроскопом наблюдаются как живые. Такое некультивируемое состояние (некультивируемая форма) присуще ряду микроорганизмов в природных местообитаниях, например, возбудителям сальмонеллеза и холеры, находящимся вне организма человека. Механизм перехода в некультивируемую форму и обратно не изучен, но есть данные о том, что этот процесс запрограммирован в геноме микроорганизмов и запускается недостатком питательных веществ в природных эконишах. В природных образцах такие микроорганизмы изучают путем прямого наблюдения и с помощью методов молекулярного анализа состава нуклеиновых кислот образца.

Размещено на Аllbest.ru

...

revolution.allbest.ru


Смотрите также

НАС УЖЕ 77 321

Подпишись на обновления сайта! Получай статьи на почту: